Обнаружение антибиотиков группы тетрациклинов в молоке методом ВЭЖХ МС/МС

1. Введение

Антибиотики группы тетрациклинов активно используются в животноводстве и на птицефабриках. Имея широкий спектр действия, они используются главным образом в качестве кормовых добавок, стимулирующих рост, и лекарственных препаратов, применяющихся для профилактики различных инфекционных заболеваний, например, желудочно- кишечного тракта. Препараты группы тетрациклинов также используются для лечения воспалительных заболеваний молочной железы, таких как мастит у лактирующих коров. Однако, антибиотики хорошо сохраняются в продуктах питания особенно в молоке. Частое употребление молока, содержащего антибиотики, может привести к аллергическим реакциям, устойчивости к лекарственным препаратам, что негативно влияет на организм человека.

Страны по всему миру следят за уровнем остаточного содержания тетрациклинов в продуктах питания.

Например, в Евросоюзе установлен максимальный уровень остатка тетрациклинов в молоке в количестве 0,1 мг/кг. В России согласно ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции», содержание тетрациклинов в пищевых продуктах должно быть не более 0,01 мг/кг. Количественное содержание антибиотиков определяется согласно ГОСТ 31694-2012 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

В данной работе предлагается разработанный быстрый и высокочувствительный метод определения остатков тетрациклинов в молоке методом ультра- эффективной жидкостной хроматографии с тройным квадрупольным тандемным масс-спектрометром технологии EXPEC.

2. Эксперимент

2.1 Стандартные образцы, реагенты и оборудование

Стандарты вещества: стандарт 4-х тетрациклинов приобретён у Shanghai Anpel и хранился в холодильнике при -20°C. Реагенты: метанол и ацетонитрил хроматографически чистые, муравьиная кислота хроматографически чистая, процентное содержание веществ в растворе от 98%.

Оборудование: УВЭЖХ 510 ультра- высокоэффективный жидкостной хроматограф (специально оснащен инфузионным бинарным насосом ультравысокого давления, автосамплером ультравысокого давления (с функцией охлаждения) и термостатом колонки), EXPEC 5210 трехквадрупольный масс-спектрометр.

2.2 Условия УВЭЖХ и масс-спектрометрического детектирования

Режим мониторинга – ММР (мониторинг множественных реакций). Параметры пар ионов, времени сканирования (dwell time), потенциал декластеризации (cone voltage) и энергия соударения (collision energy) для мониторинга приведены в таблице ниже.

2.3      Подготовка образца

Первоначально проводили экстракцию анализируемых веществ из образца. Отбирали 5 г гомогенизированного образца с точностью до 0,01 г и помещали в тубу объемом 50 мл. Затем добавляли 0,1 М буферный раствор ЭДТА-Mcllvaine и доводили до метки. Перемешивали в течении 1 мин, затем проводили ультразвуковую экстракцию в течении 10 минут. После переносили в центрифужную пробирку и охлаждали до 0-4⁰С градусов, затем центрифугировали при 5000 об/мин в течении 10 минут (при температуре -15⁰С) и отбирали супернатант.

Очистку экстракта проводили методом твердофазной экстракции (ТФЭ). 10 мл экстракта (что соответствует 1 г образца) пропускали через колонку для ТФЭ Oasis HBL (с 60 мг сорбента, 3 мл). Колонку предварительно обрабатывали 5 мл метанола и 5 мл воды. После промывали 5 мл деионизированной воды, затем 5 мл смесью метанолом с водой (5:95). Далее осушали фазу колонки под давлением 2.0 кПа или меньше в течении 5 мин. Элюирование проходило с помощью последовательной загрузки 10 мл метанола с этилацетатом (1:9). Элюат концентрировали под током азота до сухого остатка (температура до 40°C), затем растворяли в 1 мл (для жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией) или в 0,5 мл (для высокоэффективной жидкостной хроматографии) раствора метанола с уксусной кислотой (5:95). Перед анализом пробу пропускали через мембранный фильтр с размерами пор 0,45 мкм.

3.   Результаты

3.1   Линейность и предел обнаружения 

Разбавление стандартов осуществлялось ацетонитрилом для достижения серии стандартных растворов с различной концентрацией (50 мкг/мл, 100 мкг/мл, 150 мг мл, 500 мкг/мл и 700 мг/мл) антибиотиков группы тетрациклинов, анализ проводили согласно описанному методу. Для построения калибровочной кривой по оси ординат (Y) были расположены площади хроматографического пика выбранного характеристического иона для каждого исследуемого компонента. По оси абсцисс (Х) отмечена массовая концентрация раствора, определяемого стандартна и для нормализации кривой был применен метод весовых коэффициентов по формуле 1/х. Калибровочная кривая, построенная по методу внешнего стандарта представлена на рис. 1-4.

Хроматограмма характеристического иона целевых веществ в нижней точке калибровочной кривой изображена на рис. 5. Для анализа пределов обнаружения и количественного определения использовался стандартный раствор с концентрацией 50 мкг/мл при значениях сигнал/шум 3 и 10 соответственно. Полученные результаты представлены в таблице 2.

3.2      Прецизионность

Для подтверждения сходимости результатов анализа (время удерживания вещества и площадь пика) были параллельно проанализированы растворы стандартных веществ с концентрацией 50 мкг/мл и 100 мкг/мл в 6-ти повторениях для каждой концентрации. Полученные результаты приведены в таблицах ниже.

По полученным данным стоит отметить хорошую прецизионность результатов анализа, составляющую менее 3,99% для значений времени удерживания
и площади пика каждого исследуемого вещества.

4.   Вывод

После экстракции образцы молока подвергаются дополнительной очистке с помощью твердофазной экстракционной и определяются с помощью системы ВЭЖХ-МС/МС. Проведено исследование линейности, повторяемости и чувствительности метода анализа тетрациклинов в молоке с использованием УВЭЖХ-МС/МС. Полученные данные отражают линейность построенной калибровочной кривой для антибиотиков группы тетрациклинов в диапазоне обнаружения, с коэффициентом корреляции более 0,99; отклонение сходимости результатов метода находится в пределах 3.99%. Система EXPEC5210 может быть использована для эффективного количественного определения остаточного содержания антибиотиков группы тетрациклинов в молоке.