Оборудование, необходимое для проведения ПЦР

Полимеразная цепная реакция — один из самых точных методов молекулярной диагностики. Она позволяет выявлять следовые количества ДНК и РНК, что делает ПЦР незаменимой в медицине, ветеринарии, судебной экспертизе и аграрной отрасли.

Для получения достоверного результата важно не только соблюдение методики, но и корректно подобранное оборудование. В статье разберём, как работает метод, где он применяется, какие этапы включает и какое требуется оборудование для ПЦР.

Принцип метода ПЦР

Анализ основан на множественном копировании определённого участка ДНК или РНК в лабораторных условиях. Это происходит под влиянием ферментов, которые запускают синтез нужного фрагмента при соблюдении заданных температурных режимов. Если в пробе действительно есть целевой фрагмент, его копии начинают быстро накапливаться. Благодаря этому становится возможным зафиксировать наличие генетического материала даже при его минимальном исходном количестве. Исследуемый образец помещают в термоцикл, где поочерёдно происходят стадии денатурации, отжига праймеров и синтеза. Каждая новая цепочка становится основой для следующего цикла. Спустя несколько десятков таких повторов концентрация материала возрастает до миллионов копий.

ПЦР отличается точностью и позволяет выявлять возбудителей, мутации или нарушения, остающиеся незаметными другими методами. Это особенно важно при диагностике на ранней стадии, когда содержание патогенного материала незначительно.

Виды ПЦР

Полимеразная цепная реакция появилась в 1983 году и с тех пор активно развивается. Современные версии метода адаптированы под разные цели и типы анализируемого материала. В лабораториях чаще всего применяют три основные варианта:

Классическая ПЦР. Этот метод позволяет установить, есть ли в образце целевой участок генетического материала. Речь идёт о качественном анализе: результат показывает только факт наличия или отсутствия нужной ДНК. Метод применяют, например, для подтверждения заражения или при идентификации образцов.

В режиме реального времени. Этот вариант позволяет не только подтвердить наличие патогена, но и определить его количество. На протяжении всего цикла амплификации фиксируется уровень флуоресценции, что даёт возможность отслеживать накопление продукта в реальном времени. Такой подход позволяет оценить тяжесть инфекции и на основе данных скорректировать схему лечения.

С обратной транскрипцией. Этот метод применяется, если исследуемый материал содержит РНК, а не ДНК. В этом случае сначала проводится преобразование РНК в ДНК. Для этого используется фермент — обратная транскриптаза. После этого полученная ДНК уже может быть подвергнута амплификации. Метод необходим для выявления РНК-вирусов и других возбудителей, не имеющих двухцепочечной ДНК-структуры.

Оборудование и расходные материалы для ПЦР

Для проведения ПЦР анализа необходимо оборудование определенного типа.

Оно подбирается в зависимости от типа анализа, формата лаборатории и задач исследования. Амплификатор — основной прибор, без которого проведение ПЦР невозможно. Его ещё называют термоциклером. Задача устройства — обеспечивать точное чередование температурных режимов, необходимых для прохождения каждого цикла реакции.

В ходе работы амплификатор последовательно нагревает и охлаждает образец. Прибор работает автоматически и позволяет программировать точные параметры реакции — количество циклов, продолжительность каждого этапа, температурные значения.

Существуют два типа амплификаторов:

• классический — используется при проведении анализа с последующей детекцией через электрофорез;
• в режиме реального времени — дополнительно оснащён системой флуоресцентной регистрации. Такой прибор позволяет отслеживать накопление продукта в процессе амплификации и получать результат сразу после окончания цикла.

Амплификаторы могут отличаться по количеству ячеек, скорости нагрева, точности поддержания температуры и совместимости с расходными материалами.

Вместе с амплификатором в лаборатории используется целый комплекс оборудования и расходных материалов, обеспечивающих корректное выполнение каждого этапа анализа:

Ламинарный бокс II класса. Обеспечивает стерильные условия при работе с образцами. Воздушный поток защищает образец от загрязнения, а также предотвращает распространение аэрозолей за пределы бокса. Это особенно важно на этапе пробоподготовки.

Центрифуга. Используется для разделения компонентов в пробирках. В лабораториях может применяться как стандартная центрифуга, так и компактный вортекс — для быстрого перемешивания реагентов и проб.

Термостат. Позволяет поддерживать стабильную температуру, обычно в диапазоне от 65 до 95 °C. Используется на этапе инкубации или при подготовке образцов, где требуется выдержка при заданной температуре.

Холодильники. Для хранения реагентов, проб и готовых растворов необходимы холодильные установки. Чаще всего применяют два типа: с диапазоном +2…+8 °C и морозильник на –20 °C.

Дозаторы. Точные ручные или электронные дозаторы используются для переноса малых объёмов жидкостей. Очень важно подбирать объём с высокой точностью, особенно при работе с праймерами и ферментами.

Вакуумный насос. Применяется в системах фильтрации и при работе с пробами, где необходима быстрая и чистая обработка. Иногда используется для удаления жидкостей в пробирках с минимальным остатком.

Пробирки. Рабочий расходный материал. Используются микропробирки объёмом от 0,2 до 2 мл, устойчивые к циклическому нагреву. Материал должен быть совместим с ПЦР.

Наконечники для дозаторов. Одноразовые наконечники защищают дозатор от загрязнения. Используются варианты с фильтром — для предотвращения аэрозольного переноса — и без фильтра, если не требуется дополнительная защита.

Штативы. Применяются для хранения и упорядочивания пробирок, наконечников и дозаторов. Позволяют соблюдать порядок и минимизировать риск перекрёстного загрязнения.

ПЦР-бокс. Рабочее место, где проводится подготовка реакционной смеси. Оснащён УФ-лампой для дезинфекции и защитным экраном. Используется на подготовительном этапе перед амплификацией.

Дополнительное оборудование для ПЦР по конечной точке

В лабораториях, где анализ проводится по конечной точке с визуализацией результата через электрофорез, дополнительно используется специальное оборудование. На этапе пробоподготовки задействуется микроцентрифуга — она позволяет осаждать и разделять компоненты пробы. Для визуализации ПЦР-продукта применяют источник тока и трансиллюминатор. ДНК-фрагменты, окрашенные специальными реагентами, становятся видимыми при воздействии ультрафиолета.

Для фиксации и обработки результатов используется гелевая камера с системой документирования, которая подключается к компьютеру. Это позволяет не только получить изображение геля, но и сохранить его в цифровом виде. Кроме того, в процессе работы применяются дозаторы переменного объема, одноразовые наконечники без фильтров, штативы, столики для заливки гелей, гребёнки, стеклянные цилиндры, колбы, СВЧ-печь и холодильник для хранения реагентов. Все перечисленные элементы необходимы для получения точного результата при визуальной фиксации амплифицированного материала.

Этапы ПЦР

Каждый шаг требует точности и соблюдения температурного режима. Последовательность действий влияет на результат, поэтому технология строго стандартизирована.

1. Пробоподготовка. На этом этапе выделяют нуклеиновые кислоты из образца. Образцом может быть кровь, слизь, слюна, ткань или другой биологический материал. Важно исключить посторонние примеси, которые могут повлиять на точность анализа. После выделения ДНК или РНК переходят к следующему этапу.
2. Амплификация. Материал помещается в амплификатор, где проходят циклы температурных изменений. Каждый цикл включает:
   • денатурацию — разрыв связей между цепями ДНК;
   • отжиг праймеров — присоединение коротких фрагментов, задающих границы копируемой области;
   • элонгацию — синтез новой цепочки ферментом ДНК-полимеразой.

   Циклы повторяются 30–40 раз, что приводит к значительному увеличению числа копий нужного участка.

3. Детекция. Заключительный этап — считывание результата. В классической реакции проводят электрофорез, чтобы визуализировать продукт. При использовании ПЦР в реальном времени данные поступают напрямую с прибора в цифровом виде. Если в пробе есть целевой фрагмент, будет зафиксирован положительный результат.

Применение ПЦР

Метод используется в самых разных областях — от клинической диагностики до аграрных исследований. С его помощью выявляют инфекционные заболевания, устанавливают родство, обнаруживают наследственные мутации и уточняют генетические особенности организма. Метод позволяет выявить возбудителей даже при минимальном количестве ДНК или РНК, что делает его эффективным на ранних стадиях заболевания.

ПЦР востребована не только в медицине. Её применяют в ветеринарии, для контроля здоровья животных, в судебной экспертизе — для анализа биологических следов, а также в растениеводстве при проверке семенного материала и мониторинге патогенов. Метод хорошо адаптируется под задачу и даёт достоверный результат при правильно выстроенной лабораторной схеме.

Преимущества и недостатки ПЦР

Полимеразная цепная реакция считается одним из самых надёжных методов молекулярной диагностики. Её используют в случаях, когда требуется высокая точность при обнаружении следов ДНК или РНК в образце. Даже при низкой концентрации материала метод позволяет получить достоверный результат.

Преимущества:

• Чувствительность — позволяет выявить минимальные количества генетического материала. Вероятность ложноотрицательного результата крайне низкая и может достигать 90–100%.
• Специфичность — реакция запускается только при наличии нужного фрагмента, поэтому исключается ложное подтверждение в случае отсутствия искомого материала.
• Скорость — результат можно получить уже через 24 часа, в то время как микробиологические посевы или ИФА требуют нескольких суток.
• Независимость от условий роста микроорганизмов — метод не требует культивирования, поэтому подходит для возбудителей, которые сложно или невозможно вырастить в лаборатории.
• Подходит для РНК и ДНК — универсальность метода делает его применимым в самых разных областях, включая вирусологию, генетику и судебную экспертизу.

Вместе с этим, метод «заточен» под поиск одного конкретного фрагмента. Если в образце присутствуют другие патогены, ПЦР их не зафиксирует. Поэтому при смешанных инфекциях потребуется серия отдельных исследований. Кроме того, к стерильности предъявляются высокие требования. При малейшем загрязнении может произойти перекрёстная амплификация, что повлияет на точность.

Несмотря на ряд ограничений, метод остаётся одним из ключевых инструментов современной лабораторной практики. А при правильно подобранном оборудовании и соблюдении технологии он даёт воспроизводимый результат за короткое время.