Определение остаточного содержания метаболитов нитрофурана в свиной продукции методом ВЭЖХ-МС/МС

Стандарт: ГОСТ 32014-2012

Метаболиты нитрофурана – разновидность синтетических противомикробных средств широкого спектра действия. Их общие метаболиты включат: 3-амино2-золидинон (АОЗ), 5-метилморфолино-3- амино-2-золидинон (АМОЗ), 1-аминогидантоин (АГД) и семикарбазон (СЕМ). Они используются в качестве кормовой добавки для лечения желудочно-кишечных заболеваний у скота и птицы. Хотя эти препараты имеют хроническую токсичность, они активно используются в животноводстве и птицеводстве. Из-за быстрого метаболизма данных веществ в организме животных их метаболиты связываются с белками формируя прочные комплексы, которые потенциально имеют канцерогенное и тератогенное воздействие на человеческий организм и имеют длительное остаточное действие на животных и окружающую среду. Поэтому они были запрещены к использованию в производстве продукции животного происхождения во многих странах.

В России установлен максимально допустимый уровень остаточного содержания нитрофуранов в продуктах животного происхождения, который не должен превышать концентрацию в 1 мкг/кг согласно СанПиН 2.3.2.1078-01. Количественное определение остаточного содержания нитрофуранов в пищевой продукции осуществляется по ГОСТ 32014-2012 «Продукты пищевые, продовольственное сырье. Метод определения остаточного содержания метаболитов нитрофуранов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

В данной работе предлагается разработанный быстрый и высокочувствительный метод определения остаточного содержания метаболитов нитрофурана в свиной продукции с применением ультра- высокоэффективной жидкостной хроматографии с тройным квадрупольным тандемным масс- спектрометром технологии EXPEC.

2.   Эксперимент

2.1   Стандартные образцы, реагенты и оборудование

Стандарты метаболитов нитрофурана: смесь из 4-х стандартов метаболитов фурана (АОЗ, АМОЗ, АГД и СЕМ) и смесь внутренних стандартов 4-х метаболитов (d4-АОЗ, d5-АМОЗ, (C13)3-АГД и 1,2-N15,C13-СЕМ) приобретены у Shanghai Anpel и хранились в холодильнике при -20°C. Реагенты: ацетонитрил, метанол, этилацетат, н-гексан и вода хроматографически чистые, муравьиная кислота с чистотой 98% для ВЭЖХ, концентрированная соляная кислоты, о-нитробензальдегид, тригидрат фосфата калия и ацетат аммония, все реактивы с чистотой для анализа.

Оборудование: УВЭЖХ 510 ультра- высокоэффективный жидкостной хроматограф (специально оснащен инфузионным бинарным насосом ультра-высокого давления, автосамплером ультра-высокого давления (с функцией охлаждения) и термостатом для колонки), EXPEC 5210 трехквадрупольный масс- спектрометр.

2.2      Условия УВЭЖХ и масс-спектрометрического детектирования

Режим мониторинга – ММР (мониторинг множественных реакций). Параметры пар ионов, времени сканирования (dwell time), потенциал декластеризации (cone voltage) и энергия соударение (collision energy) для мониторинга приведены в таблице ниже. Для улучшения чувствительности обнаружения, соединения могут исследоваться по отдельности, в зависимости от их времени удерживания.

2.3 Подготовка образца

Образец извлекался и охлаждался до комнатной температуры. Добавляли 1-2 мл 0,3 М фосфорной кислоты, доводили до рН 7.4 (±0.2) 2.0 М гидроксидом натрия. Затем проводили экстракцию добавляя 10-20 мл этилацетата (объем этилацетата соответствовал объему соляной кислоты) и встряхивали в течение 10 минут. Центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин и отбирали органический слой. После проводили повторную экстракцию 10-20 мл этилацетатом. Полученные экстракты объединяли и высушивали в токе азота при 40°C. Высушенный остаток растворяли в 1 мл 0.1% водного раствора муравьиной кислоты. Затем проводили двухфазное жидкостное распределение с использованием 3 мл насыщенного раствора н-гексана для удаления жиров. Нижняя водная фаза пропускалась через мембранный фильтр 0,20 мкм и отбиралось 10 мкл для анализа.

3.1   Линейность и предел обнаружения Разбавление стандартов осуществлялось ацетонитрилом для достижения серии стандартных растворов с различной концентрацией (1 мкг/мл, 3 мкг/мл, 5 мг/мл, 7 мкг/мл, 10 мг/мл, 10 мг/мл, 30 мг/мл и 50 мг/мл), анализ проводился согласно описанному методу. Для построения калибровочной кривой по оси ординат (Y) были расположены площади хроматографического пика выбранного характеристического иона для каждого исследуемого компонента. По оси абсцисс (Х) отмечена массовая концентрация раствора определяемого стандартна и для нормализации кривой был применен метод весовых коэффициентов по формуле 1/х. Калибровочная кривая, построенная по методу внешнего стандарта представлена на рис. 1-4. Хроматограмма характеристического иона целевых веществ в нижней точки калибровочной кривой изображена на рис. 5. Для анализа пределов обнаружения и количественного определения использовался стандартный раствор с концентрацией 1 мкг/мл при значениях сигнал/шум = 3 и 10 соответственно. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Рис. 1 Калибровочная кривая АГД

Рис. 2 Калибровочная кривая АМОЗ

Рис. 3 Калибровочная кривая of АОЗ

Рис. 4 Калибровочная кривая СЕМ

Рис. 5 Хроматограмма в точке предела количественного определения метаболитов нитрофурана (1 мкг/мл, внутренние стандарты АОЗ-D4, АМОЗ-D5, AHD-13C3 и SEM-13C-15N2 с концентрацией 10 мкг/мл)

Для подтверждения сходимости результатов анализа (время удерживания вещества и площадь пика) были параллельно проанализированы растворы стандартных веществ с концентрацией 1 мкг/мл и 5 мкг/мл в 6-ти повторностях для каждой концентрации. Полученные результаты приведены в таблицах ниже.

Таблица 3. Сходимость результатов анализа при концентрации 1 мкг/мл: значение относительного стандартного отклонения (RSD) времени удерживания и отклика составило 0.54%-0.88% и 1.91%-4.09% соответственно.

Таблица 4. Сходимость результатов анализа при концентрации 5 мкг/мл: значение относительного стандартного отклонения (RSD) времени удерживания и отклика составило менее 0.22% и 0.78%-2.94% соответственно.

По полученным данным стоит отметить хорошую прецизионность результатов анализа, составляющую менее 4,09% для значений времени удерживания и площади пика каждого исследуемого вещества.

Образцы свининой продукции подвергают гидролизу, дериватизации, экстрагируют и отчищают в качестве предварительной обработки аналита, затем анализируют методом ВЭЖХ-МС/МС.

Было проведено исследование линейности, повторяемости и чувствительности метода. Полученные данные свидетельствуют о хорошей линейности метаболитов нитрофурана в пределах диапазона обнаружения, коэффициент корреляции составил более 0,99, отклонение сходимости результатов находится в пределах 4,09%. Система EXPEC5210 может быть использована для эффективного количественного определение остаточного содержания метаболитов нитрофурана в свиной продукции.