Хроматография — определение, история и методы

Хроматография позволяет определить качественный и количественный состав органических веществ, в том числе летучих углеводородов и биологических жидкостей. Хроматографический анализ используется практически во всех сферах производства, в фармацевтике, медицине, а также для обеспечения социальной безопасности. Большое разнообразие и специфика метода обуславливает его широкое распространение. В статье мы рассмотрим особенности, историю возникновения, виды и сферы применения хроматографического разделения.

Суть и специфика

Хроматографическое исследование основано на дифференциации и определении состава смеси в системе подвижной и неподвижной фаз. Неподвижная (стационарная) фаза представляет собой твердый материал с порами (сорбент). Для этого также подходят различные жидкие субстанции, образующие тонкий слой на сорбенте.

Сорбент помещают в трубку (колонку), выполненную из стекла или металла. Подвижная фаза (растворитель) — это то, что «толкает» исследуемый материал через стационарную фазу. В качестве растворителя подходит жидкость или инертный газ.

Подготовленный объект исследования (сорбат) смешанный с растворителем передвигается вдоль сорбента. При этом молекулы сорбата будут двигаться с разной скоростью. Дело в том, что частицы смеси имеют разную структуру, форму, размер относительно друг друга, а также разные адсорбционные связи. Поэтому в процессе движения по стационарной фазе одни частицы останутся в верхнем слое сорбента, поскольку некоторые молекулы вещества будут иметь «крепкую» связь с молекулами сорбента, а молекулы подвижной фазы не смогут увлечь их за собой.

Другие частицы останутся в нижней части трубки, поскольку они меньше взаимодействуют с сорбентом. Третьи выйдут из колонки вместе с растворителем. Такие соединения называются неудерживаемыми. Время их удержания определяется как «мертвое время колонки». Это время используется для вычисления фактора емкости, линейной скорости и логарифмических индексов.

Особенности процесса:

Мягкие условия разделения. Чаще всего, хроматографическое разделение осуществляется при атмосферном давлении и обычной температуре. Тогда как, например, перегонка проводится в более жестких условиях при высоких температурах с глубоким вакуумированием.

Высокая эффективность. Можно разделить даже близкие по происхождению, структуре и свойствам вещества. Поэтому метод широко используется в разных областях научных исследований, в лабораторной практике, промышленности.

Стоит отметить, что до открытия хроматографии невозможно было разделить смеси аминокислот и углеводородов на отдельные компоненты, а также выделить чистые ферменты веществ.

История возникновения хроматографических исследований

Отцом хроматографического разделения признается русский ученый Михаил Семенович Цвет. В 1900 году он провел опыт по очистке хлорофилла, что и заложило основы хроматографии. Эксперимент заключался в следующем: экстрагированный хлорофилл (толченые листья с эфиром) ученый вводил в трубку с толченым мелом.

В верхней части трубки образовалась зона, окрашенная в зеленый цвет. М.С. Цвет промывал колонку растворителем (бензолом). Предполагалось, что зеленый очищенный хлорофилл выйдет из другого конца трубки.

Но вместо этого, ученый получил 7 разных зон, окрашенных в разные оттенки. М.С. Цвет приписал каждую зону к определенному компоненту хлорофилла, в чем был абсолютно прав. Ученый назвал этот метод хроматография (от греч. «хром» — цвет, «граф» — писать), а первые упоминания о нем появились в статьях ученого для немецкого журнала в 1906 году.

21 марта 1903 года в публикациях Варшавского университета появилась программная статья М.С. Цвета «О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу». Эту дату можно назвать днем рождения хроматографической науки, поскольку именно тогда были заложены основы методологии. В 1907 году опыт демонстрировали членам Немецкого Ботанического общества.

До 30-х годов 20 века способ разделения применялся очень мало, поэтому о его развитии не могло быть и речи. Но в 1931 году о нем вновь заговорили. Немецкий ученый Р. Кун в стенах Гейдельбергского университета выделил хроматографическим способом альфа и бета каротин из сырого каротина. За это Р. Куну присудили Нобелевскую премию в 1939 году.

Следующим важным шагом в развитии науки стало открытие А. Мартином и Р. Лоуренсом жидкостной распределительной хроматографии. Их открытие основывалось на различии в коэффициентах распределения элементов между двумя несмешивающимися жидкостями. В качестве сорбента ученые использовали силикагель, насыщенный водой.

В роли растворителя выступил хлороформ. Исследователи пришли к выводу, что для неподвижной базы также подходит газ. Помимо этого, А. Мартин и Р. Лоуренс стали первыми, кто использовал метод бумажной хроматографии. Вместо стеклянной трубки они использовали фильтровальную бумагу. За свои открытия в этой области, ученые были удостоены Нобелевской премии в 1952 году.

С середины 20 века хроматографический анализ интенсивно развивается, появляются новые способы дифференциации сложных соединений на компоненты. Сегодня наука находит применение не только в исследовательской сфере, но и в практической деятельности человека: промышленности, фармакологии, контроле состояния окружающей среды и в других отраслях.

Виды хроматографического анализа

Активное изучение способов дифференциации смеси породило множество хроматографических методов. Все методики можно разделить на группы по признакам:

• агрегатное состояние подвижной/стационарной фаз;
• техника протекания процесса;
• механизм разделения/определения соединений;
• способ получения данных анализа;
• задачи хроматографического исследования.

Рассмотрим более подробно каждую классификацию и виды хроматографического анализа.

Классификация по агрегатному состоянию сорбента-растворителя

Как уже упоминалось выше, в качестве подвижной/неподвижной фазы выступают жидкости и газоносители. Логично предположить, что и хроматографическая дифференциация бывает газовой и жидкостной. Каждый вид делится еще на подгруппы.

Газовая хроматография (ГХ) анализирует летучие, термостабильные смеси. Такими характеристиками обладают около 5% открытых органических соединений, но именно они составляют около 80% соединений, которые используются в производстве и быте человека.

В роли растворителя здесь выступает инертный газ. Его пускают сквозь сорбент, обладающий большой поверхностью. В качестве газоносителя подходят водород, гелий, азот, аргон, углекислый газ. Из-за высокой опасности и стоимости их применяют редко, поэтому для ГХ чаще всего применяется азот. Газоноситель «увлекает» за собой молекулы исследуемой пробы по колонке. При этом он не обменивается молекулами ни с сорбентом, ни с сорбатом.

В зависимости от агрегатного состояния стационарной фазы, ГХ бывает:

• газожидкостная — в роли стационарной фазы выступает жидкость, которая наносится на инертный носитель;
• газоадсорбционная (газотвердофазная) — в качестве сорбента выступают твердые составы с удельной поверхностью 10-100 м²/г (активный уголь, силикагели, пористое стекло, оксид алюминия).

Разделение веществ производится при разных температурах. Разделенные в потоке газа компоненты поступают в детекторы. Регистраторы фиксируют изменения по времени, вырисовывается хроматограмма. Достоинства метода в том, что он позволяет быстро провести анализ, обладает широкими возможностями применения и позволяет определить состав пробы с высокой точностью.

Жидкостная хроматография (ЖХ) применятся для дифференциации нелетучих соединений, которые находятся в растворах в виде молекул и ионов. Именно этот способ был впервые использован М.С. Цветом для очищения хлорофилла. Методика позволяет разделить более широкий круг смесей, чем газовое разделение. Это связано с тем, что большая часть веществ не обладает летучестью, не устойчивы при высоких температурах.

Жидкостная подвижная фаза является активным элюентом (транспортировщиком). Частицы элюента могут собираться на сорбенте, поэтому при прохождении через трубку молекулы исследуемого вещества вытесняют молекулы жидкости. Используя разные субстанции, можно изменять параметры удерживания и селективность системы.

Неподвижная фаза здесь может быть в любом агрегатном состоянии, поэтому ЖХ бывает следующих типов:

• жидкостно-жидкостная — определение компонентов осуществляется на основании разной степени растворимости в системе фаз;
• жидкостно-твердофазная — дифференциация осуществляется за счет разной адсорбации и десорбации (т.е. за счет разной концентрированности молекул и разной силы взаимодействия с сорбентом);
• жидкостно-гелевая — в основе принципа лежит способность полимерных молекул разных размеров проникать внутрь гелевых зерен, которые образованы из полимерных сеток.

С развитием ЖХ произошел переход от классической к высокоэффективной ЖХ (ВЭЖХ). Здесь уже используются сорбенты с меньшим размером частиц, нагнетательные насосы, чувствительные детекторы. ВЭЖХ позволяет дифференцировать и определять молекулы, ионы, разделять макромолекулы и биологически активные молекулы. Преимущества ВЭЖХ в том, что она может применяться к большинству веществ. Кроме того, ВЭЖХ позволяет автоматизировать разделение и анализ сложных смесей, дает быстрый и точный результат.

Хроматографический анализ по технике выполнения

В зависимости от геометрии системы выделяются колоночная и планарная (плоскостная) хроматография. Планарная делится еще на 2 группы:

• бумажная — анализ производится на специальной бумаге, например, на фильтровальной;
• тонкослойная — сорбентом выступает тонкий слой твердого материала.

В колоночном способе хроматографического разделения используют насадочные или капиллярные колонки. В первом случае колонка заполняется сорбентом, во втором — внутренняя стенка трубки покрывается жидкостной пленкой или напылением адсорбента. Колоночная хроматография занимает доминирующие позиции в анализе проб, поскольку дает максимально точные результаты.

Классификация по механизмам дифференциации компонентов

В основе этого определения состава лежит специфика взаимодействия между анализируемой пробой и сорбентом. Выделяются следующие типы:

• адсорбционная — разделение происходит за счет различия в адсорбируемости твердым сорбентом;
• распределительная — основана на различиях в растворимости анализируемой пробы в сорбенте (ГХ), а также в растворимости в стационарной и подвижной жидких фазах (ЖХ);
• эксклюзионная — дифференциация происходит на основе проходимости молекул разной формы и размера через поры стационарной фазы;
• ионообменная — смесь делится на элементы за счет различия в способности к ионному обмену;
• адсорбционно-комплексообразовательная — дифференциация осуществляется из-за разной прочности координационных соединений в фазах;
• осадочная — разделение заключается в способности компонентов исследуемого вещества образовывать осадки разной растворимости на стационарной фазе;
• аффинная — используется для разделения биологически активных веществ (белки, ферменты), которые вступают в связь с лигандом (химическое соединение, образующее комплекс с элементами исследуемого вещества).

Классификация по механизму взаимодействия ваз весьма условна, поскольку процесс часто протекает по нескольким механизмам.

Классификация по способу получения данных

При описании этой классификации необходимо уточнить несколько терминов:

• подвижная фаза, которая вводится в стационарную, называется элюентом (растворитель);
• смесь, которая выходит из колонки и содержит разделенные компоненты, называется элюатом.

Как раз в элюате определяется наличие тех или иных соединений исследуемой пробы. Распределение разделенных элементов в виде полос или зон называют хроматограммой.

По способу получения хроматограммы выделяются элюентная, вытеснительная и фронтальная хроматография.

Элюентая (проявительная) хроматография позволяет полностью разделить многокомпонентную смесь. Для исследования колонку промывают растворителем. Он обязательно должен иметь минимальную сорбируемость, меньше, чем у любого соединения разделяемой смеси. Растворенную в элюенте пробу прогоняют через колонку порционно, а не постоянным потоком. Вместе с исследуемой смесью продолжают пропускать элюент (элюирование).

Смысл в том, что разные элементы будут двигаться по сорбенту с разной скоростью. Скорость движения молекул зависит от сорбируемости пробы. Первые из конца колонки появляются более сорбируемые элементы, затем менее и так далее. Специальные датчики фиксируют концентрацию компонентов, а регистратор выводит кривую, где количество пиков равно количеству выделенных компонентов.

Для элюирования проще всего применять постоянный состав элюента. Такой вариант введения смеси называется изократический. При таком способе ввода исследуемой смеси состав элюента не меняется. Он подходит для разделения веществ с близким составом с неподвижной фазой.

Иногда используется градиентное элюирование, когда состав растворителя меняют по определенным правилам. При этом пропускные возможности элюента возрастают. Благодаря другому составу подвижной фазы сильно сорбируемые элементы увлекаются по колонке быстрее, время удерживания сокращается, а дифференциация вещества улучшается.

Фронтальный способ — самый простой в исполнении. В колонку непрерывным потоком вводится исследуемая смесь подвижной фазой. Из конца колонки сначала выделяется чистый элюент. Когда неподвижная фаза будет насыщена менее сорбируемым компонентом А, он будет содержаться в элюате.

Затем при насыщении сорбента соединеним В элюат будет содержать компоненты А и В. Когда стационарная фаза полностью насытится компонентам, состав входной и выходной смеси будет с точностью совпадать. При таком способе определения состава, в чистом виде можно получить только 1 компонент.

Фронтальная хроматография мало распространена в анализе компонентов, поскольку дает только представление о количественном составе пробы. Тем не менее, метод эффективен для практической деятельности человека. Например, очистка воды, воздуха. На этом принципе основано обезвреживание воздуха в противогазах.

Вытеснительный способ кардинально отличается от фронтального и элюентного. В качестве растворителя применятся элюент с большей сорбируемостью, чем проба для исследования. В сорбент сначала вводят немного пробы. Затем непрерывным потоком прогоняют элюент-вытеснитель. Подвижная фаза начинает движение, вытесняя элемент 3, который вытесняет элемент 2 и так далее. В результате исследуемое вещество перемещается впереди вытеснителя, а скорость движения смеси равна скорости движения вытеснителя. Компоненты в колонке и элюате расположены друг за другом последовательно.

Этот способ позволяет выделить чистые компоненты из исследуемого материала, но не дает количественного представления о составе. Это связано с тем, что зоны элементов не разделяются чистыми промежутками сорбента, поэтому являются достаточно четкими.

Чаще всего для определения состава используется элюетная хроматография. Если корректно выбрать условия разделения смеси, то на выходе из колонки можно получить чистые вещества. К тому же, проявительный анализ дает качественные и количественные данные об объекте исследования. Они определяются простым измерением объемов удерживания и площадей пиков компонентов на хроматограмме.

Виды хроматографического исследования в зависимости от масштаба решаемых задач

Хроматография — это научно-практическая область, перед которой стоят разные цели. Поэтому в зависимости от решаемых задач, хроматографическое разделение может быть:

• аналитическим — дифференциация смеси на отдельные соединения для качественно-количественного исследования;
• препаративным — применяется для очистки и концентрирования соединений, выделения микропримесей;
• промышленным — доведение различных продуктов больших объемов до заданной чистоты.

От целей и задач исследования зависит выбор техники исполнения процесса.

Преимущества и недостатки хроматографического анализа

С появлением хроматографии стало возможно разделение сложных органических и неорганических соединений, отделение примесей, концентрирование веществ в разбавленных растворах, проведение исследований качественного и количественного характера. Но на этом достоинства не оканчиваются. Среди достоинств метода выделяются:

• высокая эффективность дифференциации за счет динамического характера процесса и его многократности;
• в процессе используются разные виды взаимодействия подвижной и неподвижной фаз;
• на разделяемые компоненты можно накладывать гравитационные, магнитные, электрические поля, что дает возможность для более глубокого изучения;
• объединяет в себе разделение и определение нескольких элементов;
• процесс разделения происходит здесь и сейчас.

Недостатком является то, что некоторые методы требуют большего времени для реализации. Особенно в случае с дифференциацией близких по свойствам веществ. Кроме того, процедура требует тщательной подготовки, соблюдения эталонных условий, дорогостоящего оборудования.

Как осуществляется хроматографическое разделение?

Хроматографическое исследование проводится с применением специального оборудования — хроматографа. В современные устройства оснащены микропроцессорами и устройствами автоматической обработки данных. Основным узлом хроматографа является колонка, которая изготавливается из металла, пластика или стекла.

Количественные показатели вещества регистрируются с помощью детекторов:

• по теплопроводности — принцип основан на разнице в теплопроводности на входе и выходе из колонки;
• пламенно-ионизационный — используется для определения примесей органического происхождения за счет изменения электрической проводимости;
• пламенно-фотометрический — применяется чаще всего при исследовании соединений фосфора, серы, азота, в редких случаях — ртути на основании излучения частиц вещества при попадании в кислородно-водородное пламя;
• термоионый — применяется для определения фосфора или азота с помощью шарика из керамики и солей щелочного металла;
• электрозахватный — используется источник электронов, которые взаимодействуют с молекулами газа, образуя измеряемый ток;
• электрохимический — фиксируют реакции серосодержащих веществ на поверхности электролита.

Сейчас все чаще встречаются устройства с несколькими колонками, различными детекторами и автоматическими механизмами для введения пробы. Хроматограф соединен с компьютером, который содержит банк хроматографических данных.

Значение хроматографии

Хроматографическое разделение используется в разных сферах жизнедеятельности человека. Хроматография играет важную роль в технологическом контроле и автоматической поддержке оптимальных условий в различных отраслях производства: химической, газовой, пищевой и других.

Кроме того, хроматографический анализ используется для контроля качества готовой продукции в легкой и тяжелой промышленности, исследований сбросов в газовом и водном производствах.

Ни один крупный завод в России не обходится без хроматографа. Оборудование для анализа соединений используется в лабораториях санитарно-эпидемиологического надзора, центрах по экологическому контролю, токсикологических лабораториях, на ветеринарных станциях и в учреждениях защиты растений.

Хроматография активно используется в медицине для диагностики наследственных, сердечно-сосудистых, психических и неврологических заболеваний. Известно, что профиль физиологических жидкостей у больных пациентов отличается от профиля здоровых. Хроматографический анализ и контроль биохимических маркеров позволяет выявить опасные болезни, подтвердить диагноз, оценить эффективность лечения.

Сложно представить криминалистику без хроматографического анализа. Метод применяется при расследовании преступлений, связанных с наркотическими веществами, спиртными напитками, отравлениями, пожарами и т.п. В судебной экспертизе анализируют состав нефтепродуктов и ГСМ, использованные для поджогов, а также для выявления фальсификатов и подделок.

Трудно охватить все сферы использования хроматографии. Но во всех отраслях, начиная с научных лабораторий и заканчивая промышленным производством, роль метода только возрастает. Соответственно, возрастает потребность в качественном оборудовании для проведения анализа. Компания «Миллаб» является надежным поставщиком хроматографов напрямую от производителя. По всем вопросам вы можете обратиться по телефону +7 495 933-71-47.