Методы контраста в световой микроскопии

1. Метод светлого поля

Этот метод подходит для исследования прозрачных препаратов, которые содержат непрозрачные объекты, либо в них присутствуют структурные участки с разным коэффициентом преломления. Например, тонкие срезы биотканей или окрашенные шлифы минералов.

Световой пучок, образованный осветителем микроскопа, проходит сквозь образец препарата и объектив. В плоскости изображения образуется равномерно освещённое поле. Непрозрачные частицы, содержащиеся в препарате, отражают либо частично поглощают свет, образуя лучи разного уровня интенсивности. Это способствует проявлению изображения.

Метод также используется при изучении непоглощающих объектов. Но только тех, которые способны рассеивать пучок света так, чтобы основная его часть оставалась за пределами объектива.

Рис. 1 Принцип освещения по Кѐллеру. 1 – источник света, 1а – изображение источника света, 2 – коллектор, 3 – полевая диафрагма осветителя, 3а – изображение полевой диафрагмы, 4 – светофильтр, 5 – апертурная диафрагма, 6 – конденсор, 7 – препарат, 8 – объектив микроскопа

2. Метод тёмного поля

Суть темнопольной микроскопии заключается в способности некоторых микроорганизмов к интенсивному рассеиванию света. Метод подходит для получения изображений живых и неокрашенных образцов, например, одноклеточных водных организмов.

Для исследования используются стандартные объективы и особые темнопольные конденсоры. Особенность вторых в том, что их центральная область затемнена. Что исключает попадание в объектив микроскопа прямых лучей осветителя. На образец направлены только боковые лучи, за счёт чего в объективе можно наблюдать только лучи, рассеянные исследуемыми частицами. Метод базируется на эффекте Тиндаля, пример которого — видимость частиц пыли в воздухе при освещении конусообразным солнечным лучом.

Во избежание попадания в объектив прямых лучей осветителя, действующее отверстие объектива (апертура) должно быть меньшего диаметра, чем у конденсора. Для его уменьшения внутрь стандартного объектива устанавливают диафрагму либо применяют специальные оптические приборы с ирисовой диафрагмой.

Применение метода тёмного поля позволяет добиться яркого свечения микроорганизмов на чёрном фоне, за счёт чего можно обнаружить даже самые мельчайшие частицы, чьи размеры выходят за пределы разрешающей способности микроскопа. Но в этом случае можно наблюдать лишь контуры объектов, без возможности изучения их внутренней структуры.

Для изучения препаратов необходимы предметные стёкла толщиной не более 1,2 мм, не имеющие загрязнений или повреждений. Также следует не допускать наличия в образце пузырьков воздуха, крупных частиц. Необходим мощный осветитель, с максимальным накалом лампы. Настройка осуществляется в несколько этапов:

1. установка освещения по Кёлеру;
2. замена светлопольного консенсора темнопольным;
3. нанесение на верхнюю линзу дистиллированной воды или иммерсионного масла;
4. поднятие конденсора до контакта с нижней частью предметного стекла;
5. фокусировка объектива малого увеличения на образце;
6. перемещение светового пятна в центр поля зрения;
7. получение равномерно освещённого пятна путём поднятия и опускания конденсора.

После этих этапов необходимо установить объектив нужного увеличения и приступать к исследованию образца.

Рис. 2 Освещение препарата в методе темного поля в отражённом свете

3. Фазовый контраст

При изучении неокрашенных объектов, которые отличаются от окружающей среды только показателем преломления, интенсивность света не меняется. Меняется лишь фаза световых волн. Такие изменения абсолютно незаметны в светлом поле, поскольку микроорганизмы прозрачны и не имеют цвета.

Для исследования таких объектов подходит именно фазово-контрастная микроскопия. Её суть — трансформация фазовых изменений световой волны в амплитудные, видимые глазу.

Рис. 3 Фазовые пластинки

Оборудование для фазового контраста можно установить на любой световой микроскоп. Оно состоит из:

• объективов с фазовыми пластинами;
• конденсора с поворотным диском;
• вспомогательного телескопа для настройки.

Рис. 4 Устройство фазового контраста

Настройка включает следующие этапы:

• замена стандартных объективов и конденсора на фазовые (Ph);
• установка объективов малого увеличения;
• настройка освещения по Кёлеру;
• выбор и фокусировка фазового объектива;
• поворот диска конденсора, установка кольцевой диафрагмы;
• замена окуляра вспомогательным телескопом.

После этого вспомогательный телескоп необходимо настроить с помощью винтов регулировки. Затем телескоп снова заменить окуляром.

Применение этого метода позволяет добиться увеличения контрастности живых неокрашенных микроорганизмов на светлом или тёмном фоне. Таким способом исследуют клетки, вирусы, минеральные и органические компоненты.

Рис. 5. Клетка в фазовом контрасте

4. Поляризационный контраст

Поляризация применяется для исследования анизотропных объектов, обладающих двойным лучепреломлением или отражением. Это могут быть минералы, угли, кристаллы, шлаки, ткани и клетки, волокна.

Рис. 6: А - источник света. В – неполяризованный свет. С – поляризационная решётка. D –поляризованный свет

Суть метода — наблюдение образцов в свете, созданном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях. Для этого в стандартный микроскоп устанавливают два дополнительных фильтра — поляризатор и анализатор, которые расположены параллельно друг к другу. Поэтому при исследовании в тёмном поле зрения прибора можно наблюдать тёмные, светлые либо окрашенные анизотропные элементы. Их вид зависит от положения объекта относительно плоскости поляризации. Повысить точность получаемых оптических данных можно при помощи компенсаторов — клиньев и пластинок.

Рис. 7 Двойное лучепреломление

Рис. 8 Оптическая ось кристалла

5. Хоффмановский контраст

Хоффмановский контраст (ХК) — это метод косого освещения, при котором за счёт градиентности оптических фаз повышается контраст в окрашенных и неокрашенных препаратах. С его помощью можно получать трёхмерное высокоточное изображение живых образцов, что открывает большие возможности для различных научных и медицинских исследований. Большое рабочее расстояние с применением высоких числовых апертур обеспечивает точное отслеживание движения объектов.

Другие виды исследований (электрофизиология, ЭКО) требуют использования не только конденсоров, но и объективов с большим рабочим расстоянием. Хоффмановский контраст позволяет проводить послойное изучение толстых образцов, выбирая последовательность фокальных планов.

Метод может применяться на микроскопах с флуоресцентными осветителями. Исследование морфологии с применением флуоресценции или без возможно без замены образца и объективов. По сравнению с фазовым контрастом, при Хоффмановском контрасте не возникает эффект Гало — вторичное свечение по контуру изображения, мешающее получать полную информацию об объекте.

Рис. 9 Биологическое оборудование для исследования прозрачных объектов

6. Флуоресценция (люминесценция)

Некоторые невидимые при обычном свете вещества обладают способностью к люминесценции, то есть могут светиться, поглощая энергию источника. Именно на этом основана флуоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Поглощая фотоны света, образец излучает свет другой, более длинной волны фотолюминесценции (правило Стокса).

Люминесценцию провоцируют при помощи ультрафиолетового излучения либо специальных красителей. Исследование проводится с помощью специального флуоресцентного микроскопа. Его особенности:

• интенсивный световой источник с излучением преимущественно в коротковолновой части спектра (ртутно-кварцевая или галогенная кварцевая лампа);
• система светофильтров, среди которых есть возбуждающие, теплозащитные и «запирающие».

Для проявления люминесценции образцы освещают через объектив. Важную роль здесь выполняет специальная интерференционная светоделительная пластинка. Это полупрозрачное стекло, которое выборочно отражает и направляет в объектив долю спектра, провоцирующего люминесценцию, пропуская её свет в окуляр.
Оптическую систему флуоресцентного микроскопа изготавливают из специальных сортов оптического стекла, не подверженных люминесценции, склеивая их нелюминесцирующим клеем.

У большей части исследуемых частиц отсутствует собственная люминесценция, поэтому для наблюдения за ними применяются специальные способы обработки. Например, флуорохромирование — окрашивание частиц сильно разбавленными флуоресцирующими красителями.

В сравнении с обычной, флуоресцентная микроскопия открывает более широкие возможности для изучения различных клеток, их микроструктуры, функциональных и морфологических изменений.

Рис. 10 Флуоресцентный микроскоп — оптический прибор, показывающий в увеличенном виде клетки

7. Дифференциально-интерференционный контраст

Дифференциально-интерференционный контраст (ДИК) — это усовершенствованный (в сравнении с поляризационным) метод получения контраста в прозрачных образцах. Для этого исследования используют микроскоп с лучепреломляющей призмой Номарского. Она расщепляет поляризованный луч на два световых пучка, которые проходят через образец оптическими путями разной длины.

Рис. 11 Виды поляризации. Поляризация описывается фигурами Лиссажу и соответствует сложению поперечных колебаний равной частоты

Применение этого метода позволяет получать монохромное изображение, отображающее градиент высокопространственных и низкопространственных частот, содержащихся в образце. Участки образца, в которых длина оптических путей возрастает по отношению к контрольному пучку, становятся ярче или более тёмными. Участки с меньшими различиями демонстрируют обратный контраст. Чем выше градиент оптических пучков, тем более контрастным получается изображение.

Рис. 12 Схема ДИК микроскопии в проходящем свете