Хроматограф — принцип работы, виды и инструкция

Хроматография — биофизический метод разделения, идентификации и очистки компонентов смеси для качественного и количественного анализа. Хроматография применяется в различных сферах и зачастую является единственным средством разделения компонентов из сложных смесей.

В статье представлена история развития хроматографии, виды хроматографов, принцип работы и устройство различных хроматографов, критерии выбора колонок и детекторов, которые можно приобрести в Millab Group.

Назначение

Хроматография — это физический процесс разделения, при котором смесь соединений может быть разделена, выделена или очищена на отдельные молекулы. Компоненты в смеси диспергированы между двумя фазами: неподвижной фазой и подвижной, движущейся при различных скоростях в заданном направлении.

В зависимости от растворимости, аффинности, способа взаимодействия с неподвижной фазой одни компоненты смеси дольше остаются в неподвижной фазе и медленно перемещаются в хроматографической системе, тогда как другие быстро переходят в подвижную фазу и быстрее покидают систему.

История

В 1901 г. русский ботаник Михаил Семёнович Цвет изобрёл первую методику хроматографии при исследовании разделения растительных пигментов хлорофиллов, а в 1906 г. им был введён термин «хроматография».

В 1952 году Арчер Джон Портер Мартин и Ричард Лоуренс Миллингтон Синдж были удостоены Нобелевской премии по химии за изобретение распределительной хроматографии. Исследователи обнаружили, что принципы, лежащие в основе хроматографии М. Цвета, могут применяться по-разному, что привело к появлению различных видов хроматографии. Современные достижения науки позволяют разделять всё более схожие молекулы.

Сферы применения

Фармацевтическая промышленность

• Идентификация микроэлементов или химических веществ
• Разделение соединений на основе их молекулярной массы и элементного состава
• Обнаружение неизвестных соединений
• Определение чистоты смеси
• Разработка лекарственных препаратов

Химическая промышленность

• Анализ качества проб воды и воздуха
• Обнаружение загрязняющих веществ, таких как полихлорированные бифенилы
• Анализ качества нефти и нефтепродуктов

Пищевая промышленность

• Анализ качества пищевых продуктов и добавок
• Определение пищевой ценности

Криминалистика

• Анализ образцов крови и волос с места преступления

Молекулярно-биологические исследования

• Изучение метаболомики и протеомики
• Разделение белков, например, при очистке инсулина, фракционировании плазмы, очистке ферментов.

Принцип работы хроматографа

Молекулы в смеси наносятся на поверхность твёрдой матрицы, а жидкая неподвижная фаза (стабильная фаза) отделяется при движении с помощью подвижной фазы. В зависимости от адсорбционных характеристик, распределения и сродства молекулярных масс, одни компоненты смеси дольше остаются в неподвижной фазе и медленно перемещаются в хроматографической системе, а другие быстро переходят в подвижную фазу и покидают систему.

Основой любой хроматографической системы являются три составляющие:

1. Неподвижная фаза: эта фаза всегда состоит из «твёрдой» фазы или «слоя жидкости, адсорбированной на поверхности твёрдой подложки».

2. Подвижная фаза: эта фаза всегда состоит из «жидкого» или «газообразного компонента».

3. Разделённые молекулы.

Виды хроматографов

Основной целью применения хроматографии является качественное или количественное разделение компонентов смеси. Существуют различные хроматографические методы:

• Колоночная;
• Ионообменная;
• Гель-проникающая (молекулярно-ситовая);
• Аффинная;
• Бумажная;
• Тонкослойная;
• Газовая;
• С красителем-лигандом;
• Гидрофобного взаимодействия;
• Псевдоаффинная;
• Жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ);

Газовый хроматограф

Газожидкостная хроматография (ГЖХ) или просто газовая (ГХ) — это тип хроматографии, в котором подвижной фазой является газ-носитель (гелий, азот), а неподвижной фазой (колонкой) является микроскопический слой жидкости или полимера на инертной твёрдой (стеклянной или металлической) подложке внутри.

Устройство

  Рис. 1 Газовый хроматограф Agilent 7820A

При ГХ-анализе известный объём газообразного или жидкого анализируемого вещества вводится в головную часть колонки, обычно с помощью микрошприца. По мере того как газ-носитель перемещает молекулы анализируемого вещества через колонку, это движение сдерживается адсорбцией молекул анализируемого вещества либо на стенках колонки, либо на набивочных материалах в колонке.

Рис. 2 Принцип устройства газового хроматографа

Когда химические вещества выходят из конца колонки, они обнаруживаются и идентифицируются электронным способом. Скорость, с которой молекулы продвигаются по колонке, зависит от силы адсорбции, которая, в свою очередь, зависит от типа молекулы и материалов неподвижной фазы. Поскольку каждый тип молекул имеет разную скорость продвижения, различные компоненты смеси разделяются по мере их продвижения по колонке и достижения конца колонки в разное время (время удерживания).

1. Насадочные имеют длину 1,5–10 м и внутренний диаметр 2–4 мм. Трубка обычно изготавливается из нержавеющей стали или стекла и содержит насадку из мелкодисперсного инертного твёрдого материала-носителя (диатомит), покрытого жидкой или твёрдой неподвижной фазой. Для разделения конкретных типов соединений предназначены специальные колонки.

2. Капиллярные имеют длину от 25 до 60 метров и внутренний диаметр порядка нескольких десятых долей миллиметра. Внутренние стенки колонок покрыты активными веществами (колонки WCOT), некоторые колонки полутвёрдые, заполненные множеством параллельных микроспор (колонки PLOT). Большинство капиллярных колонок изготавливаются из гибкого плавленого кварца с полиимидным внешним покрытием, позволяющим сматывать колонки в маленькую катушку.

В качестве подвижной фазы преимущественно используется гелий благодаря широкому диапазону скоростей потока, взрывобезопасности и возможности работы с большим количеством детекторов.

Детектор используется для контроля потока на выходе из колонки; таким образом, можно определить время, за которое каждый компонент достигает выпускного отверстия, и количество этого компонента. Как правило, вещества идентифицируют (качественно) по порядку их появления (элюирования) из колонки и по времени удерживания в колонке.

Детектор по теплопроводности (TCD) является универсальным и может использоваться для обнаружения любого компонента, кроме газа-носителя, а пламенно-ионизационный детектор (FID) чувствителен к углеводородам, однако не может обнаружить воду.

Поскольку TCD является неразрушающим, его можно использовать последовательно перед FID (разрушающим), что обеспечивает дополнительное обнаружение одних и тех же элюентов. Другие детекторы чувствительны только к определённым типам веществ и хорошо работают только в более узких диапазонах концентраций:

• Разрядный ионизационный (DID)
• Захвата электронов (ECD)
• Фотометрический (FPD)
• Электролитической проводимости Холла (E₁CD)
• Ионизации гелия (HID)
• Азота и фосфора (NPD)
• Масс-селективный (MSD)
• Фотоионизационный (PID)
• Импульсный разрядно-ионизационный (PDD)

Все, что сообщает ГХ — это относительное время элюирования компонента из колонки и то, что детектор был чувствителен к нему. ГХ обладает рядом недостатков:

• продолжительное время разогрева колонки и анализа;
• для подтверждения результатов требуется несколько прогонов;
• далеко не все компоненты могут быть обнаружены в составе;
• для получения значимых результатов необходимо подключение дополнительного оборудования: масс-спектрометров (ГХ-МС), спектрометров ядерного магнитного резонанса (ГХ-МС-ЯМР), инфракрасных детекторов (ГХ-МС-ЯМР-ИК);
• необходимо тщательно подбирать операционную программу, сверять результаты с ГХ-анализом эталонной пробы.

Высокоэффективный жидкостной хроматограф (ВЭЖХ)

В ВЭЖХ анализируемое вещество проталкивают через колонку с неподвижной фазой (обычно это трубка, заполненная мелкими круглыми частицами с определённым химическим составом) путём прокачки жидкости (подвижной фазы) под высоким давлением через колонку.

Анализируемый образец вводится в небольшом объёме в поток подвижной фазы и замедляется за счёт специфических химических или физических взаимодействий с неподвижной фазой по мере его прохождения по всей длине колонки.

  Рис. 3 Принцип работы ВЭЖХ

Величина замедления зависит от природы анализируемого вещества, состава неподвижной и подвижной фазы. Время, в которое конкретный аналит элюируется (выходит из конца колонки), называется временем удерживания и считается достаточно уникальной идентифицирующей характеристикой данного аналита.

Использование давления увеличивает линейную скорость, давая компонентам меньше времени для диффузии в колонке, что приводит к улучшению разрешения на результирующей хроматограмме.

Используемые растворители включают любые смешивающиеся комбинации воды или различных органических жидкостей (метанол и ацетонитрил). Вода может содержать буферы или соли, способствующие разделению анализируемых компонентов.

Рис. 4 Система ВЭЖХ Agilent 1260

Выбор растворителей, добавок и градиента зависит от природы неподвижной фазы и анализируемого вещества. Часто с аналитом проводится серия тестов для подбора оптимального метода разделения пиков.

Внутренний диаметр колонки для ВЭЖХ определяет количество анализируемого вещества, которое может быть загружено в колонку, а также влияет на чувствительность.

1. С большим внутренним диаметром (более 10 мм) используются для очистки получаемых соединений.

2. С аналитической шкалой (4,6 мм) используются в традиционном количественном анализе образцов и часто используют УФ-детектор.

3. С узким отверстием (1–2 мм) используются в тех случаях, когда требуется большая чувствительность, либо со специальными УФ-видимыми, флуоресцентным или масс-детектором.

4. Капиллярные (менее 0,3 мм) используются исключительно с альтернативными средствами обнаружения, такими как масс-спектрометрия. Изготавливаются из капилляров из плавленого кварца, а не из трубок из нержавеющей стали, которые используются в более крупных колонках.

Универсального детектора для идентификации всех соединений не существует, поэтому используются комбинации детекторов:

1. UV, VIS и PDA

2. Показатель преломления

3. Испарительный детектор светорассеяния

4. Многоугольный детектор рассеяния света

5. Масс-спектрометр

6. Проводимости

7. Флуоресценции

8. Хемилюминесценции

9. Оптического вращения

10. Электрохимический

Преимущества ВЭЖХ:

• быстрый, автоматизированный и высокоточный метод распознавания;
• возможность применения градиентной системы растворителей;
• можно оснастить различными детекторами;
• обеспечивает высокое разрешение по сравнению с другими хроматографическими методами;
• высокая воспроизводимость результатов.

Недостатки ВЭЖХ:

• дорогостоящий метод, требующий большого количества органических веществ;
• ремонт, обслуживание и разработка новых методов требуют специализированных навыков;
• отсутствие универсального детектора;
• детектор UV-Vis обнаруживает только хромофорные соединения;
• разделение в ВЭЖХ менее эффективно, чем ГХ;
• надёжность насоса зависит от чистоты образца, подвижной фазы и правильной работы системы.

Где купить

В Millab Group можно приобрести газовые и жидкостные хроматографы от производителей Agilent Technologies, Bruker, INGOS, METROHM. Наши специалисты с удовольствием ответят на ваши вопросы и помогут подобрать хроматограф в зависимости от решаемых задач для достижения желаемого результата!

Автор: Аспирант кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева

Баурина Александра Владимировна